Jewawut (Setaria italica L.) adalah tanaman sereal anggota keluara rumput Poaceae. Akar jewawut diklasifikasikan sebagai akar serabut dan terdiri dari akar prime dan skunder yang saat ini belum ada penelitian pengenai baktri rhizosfer penambat nitrogen pada perakaran tanaman jewawut. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui isolasi dan uji kemampuan bakteri penambat nitrogen dari rhozosfer perakaran tanaman jewawut untuk menghasilkan sumber belajar biologi dalam bentuk booklet. Pendekatan yang digunakan pada penelitian kuantitatif, sampel pada penelitian ini adalah rhozosfer perakaran dari tanaman jewawut. Data penelitian dianalisis secara deskriptif kuantitatif yaitu meliputi karakteristik makroskopis dan mikroskopis yang meliputi uji penambat nitroge, uji IAA dan Giberelin GA3 serta identifikasi bakteri berbasis 16S rRNA dari masing-masing bakteri yang berhasil diisolasi dari rhozosfer perakaran tanaman jewawut. Hasil penelitian menunjukkan bahwa isolat yang dapat menembat nitrogen yaitu jewawut muda pinggir rhizosfer (JMPR), pewarnaan Gram 5 isolat bergram negatif dan 5 isolat lainnya bergram positif dengan bentuk didominasi coccus. Uji penambat nitrogen 5 isolat dapat menembat nitrogen dilihat adannya cincin yang terbentuk dengan kode isolat JMPR19, JMPR22,JMPR28,JMPR29, dan JMPR31. Sebanyak 3 isolat dapat menghasilkan IAA dan Giberelin GA3 dan 2 isolat berhasil dianalisi BLAST yang menunjukkan tingkat kemiripannya pada species Bacillus Toyonensis dan Bacillus Cereus. Hasil penelitian ini kemudian diimplementasikan ke dalam bentuk booklet sebagai sumber belajar biologi dengan materi bakteri.